hola a todos?
y que esta pasando con la pandemia de la gripa porcina?
crees en lo que dicen?
que es una guerra microbiologica?
que es una mutación?
que será?
una bacteria?
un Parasito?
un virus?
La gripe porcina es una enfermedad vírica muy contagiosa de los cerdos. Las infecciones por el
virus de la gripe porcina (SIV) causan una enfermedad respiratoria caracterizada por tos,
estornudos, descargas nasales, temperatura rectal elevada, letargia, dificultades respiratorias y
apetito reducido. En algunos casos, las infecciones por SIV se asocian a trastornos en la
reproducción, como abortos. Los síntomas clínicos y la excreción nasal del virus pueden aparecer
a las 24 horas de la infección. En infecciones por SIV las tasas de morbilidad pueden alcanzar el
100%, aunque las de mortalidad son relativamente bajas. Las infecciones bacterianas secundarias
pueden agravar los síntomas clínicos de una infección por SIV. La transmisión se realiza por
contacto a través de secreciones que contengan SIV, como aerosoles originados por la tos o el
estornudo y por las descargas nasales.
Identificación del agente: La identificación del virus es más fácil cuando se recogen muestran a
las 24–48 horas de la aparición de los síntomas clínicos. El cerdo de elección es un animal sin
tratar con manifestación aguda y temperatura rectal elevada. El virus puede detectarse fácilmente
en el tejido pulmonar y en frotis nasales. El aislamiento se puede realizar en huevos embrionados
de pollo y en líneas celulares continuas. El subtipado de los virus aislados se hace por pruebas de
inhibición de la hemaglutinación (HI) y de inhibición de la neuraminidasa. En tejidos fijados con
formalina, se puede realizar inmunohistoquímica, y en tejidos frescos, una prueba con anticuerpos
fluorescentes. También existen pruebas de reacción en cadena de la polimerasa. Se han
comercializado enzimoinmunoensayos (ELISA) para la detección del virus de la gripe tipo A.
Pruebas serológicas: La prueba serológica más importante para la detección de anticuerpos
contra el SIV es la prueba HI realizada con pares de sueros. La prueba HI es específica de
subtipos. En general los sueros se recogen distanciados 10–21 días. Un aumento de cuatro veces
o más entre el título de la primera muestra y la segunda sugiere una infección reciente por SIV.
Otras pruebas serológicas adicionales son la prueba de inmunodifusión en gel de agar, la
inmunofluorescencia indirecta, la neutralización vírica y ELISA.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se han comercializado vacunas
con SIV inactivado y con adyuvante. Las vacunas pueden contener un único subtipo de SIV o
varios subtipos. Las vacunas deben reflejar el perfil antigénico actual de los virus de campo y
contener los subtipos y cepas tan variados como sean necesarios para asegurar la protección. La
vacuna final tiene que ser pura, segura, potente y eficaz.
A. INTRODUCCIÓN
La gripe porcina es una enfermedad vírica muy contagiosa que en una piara afectada puede tener un impacto
importante (5, 16). El virus de la gripe porcina (SIV) es un ortomixovirus tipo A con un genoma de ARN
segmentado. Los virus de la gripe porcina tipo A se pueden subdividir según sus proteínas de la hemaglutinina y
de la neuraminidasa. Los subtipos de SIV que se identifican con más frecuencia en cerdos son H1N1, H1N2 y
H3N2. Otros subtipos identificados en cerdos son H1N7, H3N1, H4N6 y H9N2. Los virus H1N1, H1N2 y H3N2 de
Europa son antigénica y genéticamente distintos de los encontrados en EE.UU. (1, 2, 4, 8, 12, 15, 20). Los
cerdos tienen receptores en su tracto respiratorio que reconocen virus de la gripe porcina, humana y aviar. En
consecuencia, los cerdos se han considerado como “recipientes de mezcla” para el desarrollo de nuevos virus de
la gripe cuando los virus de la gripe porcina, aviar y/o humana se recombinan en los cerdos (13). Las infecciones
por SIV causan una enfermedad respiratoria caracterizada por tos, estornudos, descargas nasales, temperaturas
rectales elevadas, letargia, dificultad respiratoria y apetito disminuido. Entre los agentes que pueden originar una
enfermedad respiratoria en cerdos están el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, el virus de la
1192
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Page 2Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
enfermedad de Aujeszky (seudorabia), el coronavirus respiratorio porcino, Actinobacillus pleuropneumoniae y
Mycoplasma hypopneumoniae, aunque la mayoría de éstos tienen otros síntomas que no son similares a los de
la gripe porcina (11). Sólo Actinobacillus pleuropneumoniae, en infección aguda, presenta síntomas clínicos
similares a la gripe porcina, como disnea, taquipnea, respiración abdominal, tos, fiebre, depresión y anorexia. Los
síntomas clínicos y la excreción nasal pueden aparecer a las 24 horas de la infección. En el cerdo se dan dos
formas de la enfermedad, la epidémica o la endémica. En la forma epidémica el virus pasa por todas las fases
con una recuperación rápida del cerdo si no existen factores de complicación del tipo de infecciones bacterianas
secundarias. En la forma endémica los síntomas pueden ser menos aparentes, y no todos los cerdos muestran
los síntomas clínicos tradicionales de la infección. En las infecciones por SIV las tasas de morbilidad pueden
alcanzar el 100%, aunque las tasas de mortalidad son en general bajas. El impacto económico más importante
está relacionado con la pérdida de peso, que se traduce en la necesidad de un mayor número de días para
alcanzar el peso adecuado para el mercado. La transmisión se realiza por contacto con secreciones que
contienen SIV, como los aerosoles que se originan por la tos y el estornudo, y por descargas nasales. Pueden
darse infecciones por SIV en humanos y se han descrito algunas muertes. Deben tomarse precauciones para
impedir las infecciones humanas como se describe en el Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios
veterinarios de microbiología.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1. Identificación del agente
Como el SIV es un agente patógeno potencial para humanos, todo trabajo con tejidos infecciosos, frotis, huevos
embrionados y cultivos celulares debe hacerse en cámaras de seguridad biológica de tipo II.
a) Cultivo
•
Procesamiento de muestras
El tejido pulmonar puede prepararse para el aislamiento de virus de varias formas, por ejemplo en un
mortero, en un digestor, en un homogenizador, o cortándolo con la hoja de un escalpelo o con tijeras. El
procesamiento del tejido se hace en un medio de cultivo celular suplementado con antibióticos (por ejemplo,
a 10 x la concentración de trabajo), a una concentración final del 10% (p/v). La suspensión se incuba 30
minutos en la oscuridad a 20–22°C. Los frotis nasales deben ponerse en medio de cultivo celular o en
solución salina tamponada con fosfato (PBS). Al llegar al laboratorio los frotis nasales se agitan
vigorosamente a mano o en un vórtex. Tanto los frotis nasales como el tejido pulmonar se centrifugan a
1500–1.900 g durante 15–30 minutos a 4°C. Se recoge el sobrenadante y se guarda a 4°C hasta la
inoculación. Si el sobrenadante se tiene que mantener más de 24 horas antes de la inoculación, debe
guardarse a –70°C. El sobrenadante de la muestra pulmonar se inocula sin más dilución. El sobrenadante
de los frotis nasales se puede inocular también sin diluir o diluido a 1/3 con medio de cultivo. Para reducir la
contaminación bacteriana, se añaden antibióticos al medio de cultivo celular utilizado en el procesamiento
y/o el sobrenadante se filtra, aunque esto puede disminuir el título vírico.
•
Aislamiento del virus en cultivo celular
i)
El aislamiento del virus se realiza en líneas celulares susceptibles de infección por SIV. La línea celular
preferida es la Madin–Darby de riñón canino (MDCK), pero pueden emplearse líneas celulares
primarias de riñón o de testículo porcino, o del epitelio pulmonar.
ii)
Lavar tres veces las monocapas celulares confluentes (48–72 horas después de la puesta en cultivo
de las células) con medio de cultivo celular que contenga una concentración final de 2 µg/ml de
tripsina; la concentración depende del tipo de tripsina y puede utilizarse hasta 10 µg/ml. El medio se
puede suplementar con antibióticos, pero no con suero fetal bovino.
iii) Inocular el cultivo celular con una cantidad adecuada de sobrenadante de suspensión de tejido o de
frotis. Nota: el volumen de inóculo varía con el tamaño del recipiente del cultivo celular. En general se
inoculan de 100–200 µl en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos, 1 ml en cada tubo
Leighton, y 1–2 ml en una botella de 25 cm
2
.
iv)
Incubar los cultivos celulares inoculados durante 1–2 horas a 37°C. Cuando se usan cultivos celulares
abiertos al medio, como placas de cultivo, la incubación se debe realizar en una cámara húmeda con
5% de CO
2
.
v) Eliminar el inóculo y lavar la monocapa tres veces con el medio de cultivo que contiene tripsina.
vi) Añadir un volumen apropiado de medio de cultivo de mantenimiento a todos los recipientes e incubar a
37°C durante 7 días con examen periódico del efecto citopático (ECP). Si al final del período de
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1193
Page 3Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
incubación no se observa ECP, el cultivo celular se congela a –70°C, se descongela, y se siembra de
nuevo como se describió antes (paso iii). Si se observa ECP, se puede probar una alícuota del medio
de cultivo para detectar virus hemaglutinantes y se puede recoger y utilizar como inóculo para
confirmación por la técnica de inmunofluorescencia (ver Sección B.1.e. más adelante). Para este fin se
pueden inocular monocapas de MDCK (o de otra línea celular adecuada) en cubres (tubo Leighton,
placa de cultivo celular de 24 pocillos) o en portas con cámaras. El procedimiento de aislamiento es
como se describió arriba (paso iii). En algunos casos puede ser necesario hacer diluciones decimales
del virus del cultivo celular para tener un ECP apropiado en los cubres. Los subtipos de la gripe se
pueden determinar por las pruebas de inhibición de la hemaglutinación (HI) y de inhibición de la
neuraminidasa (NI).
•
Inoculación en huevo (14)
i)
Emplear huevos embrionados de pollo de 10–11 días.
ii)
Inocular 0,1–0,3 ml de inóculo en la cavidad alantoidea y en el saco amniótico; muchos laboratorios
inoculan sólo por la vía alantoidea con una sensibilidad similar. Generalmente se inoculan 4 huevos
por muestra.
iii) Incubar los huevos a 35–37°C durante 3–4 días y mirarlos al trasluz diariamente. Los huevos con
embriones muertos antes de las 24 horas de inoculación se desechan.
iv) Refrigerar los huevos con embriones muertos después de 24 horas de la inoculación. Recoger el
líquido amniótico y alantoideo de los huevos con embriones muertos y de los huevos con embriones
viables al fin del período de incubación. Este material debe considerarse potencialmente infeccioso y
tratarse adecuadamente para evitar la exposición al SIV del laborante.
v)
Centrifugar los líquidos a 1.500–1.900 g durante 10–20 minutos a 4°C. Pasar el sobrenadante a otro
tubo para prueba.
vi) Se evalúan los líquidos para presencia de SIV con la prueba de hemaglutinación (HA) (ver más
adelante).
vii) Repasar los líquidos negativos para actividad hemaglutinante (negativos para SIV) en huevos o en
líneas celulares como se describió antes. El aislamiento puede mejorarse haciendo diluciones
decimales del líquido en medio de cultivo. Se pueden añadir antibióticos al medio de cultivo.
•
Prueba de hemaglutinación
i)
Preparar una suspensión al 0,5% de eritrocitos de sangre de pavo macho o de pollo; la sangre de pavo
macho se utiliza en algunos laboratorios de EE.UU. pero no se recomienda para identificar
aislamientos europeos. Los eritrocitos lavados y las suspensiones al 0,5% se pueden guardar a 4°C
hasta una semana. Eliminarlos si se observa hemólisis.
ii)
Para cada virus desconocido, distribuir 50 µl de PBS en una fila de 12 pocillos de una placa de
microtitulación de 96 pocillos con fondo en V o en U. Debe incluirse como control otra línea de pocillos.
iii) Añadir 50 µl de aislamiento sin diluir al primer pocillo de cada fila correspondiente.
iv) Con una micropipeta, diluir en serie el aislamiento en volúmenes de 50 µl. Las diluciones resultantes
variarán de ½ (pocillo 1) a 1/2048 (pocillo 11). El pocillo 12 contiene sólo PBS y sirve como control de
células.
v)
Añadir a cada pocillo 50 µl de suspensión de eritrocitos al 0,5% y agitar la placa para mezclar bien.
Nota: mantener los eritrocitos suspendidos cuidadosamente durante el proceso de distribución.
vi) Cerrar la placa con cinta aislante e incubar a temperatura ambiente hasta que en el pocillo control se
forme un botón definido (30–60 minutos).
vii) Los pocillos con hemaglutinación completa (HA positiva, SIV presente) muestran los eritrocitos
distribuidos por todo el pocillo formando una “alfombra”. Los pocillos con un botón definido de
eritrocitos en el fondo del pocillo son negativos para actividad hemaglutinante (negativos para SIV).
Una actividad HA incompleta se manifiesta por botones parciales caracterizados por márgenes difusos
o con apariencia de “donut”. Cuando la interpretación entre completa e incompleta es dudosa, se
voltea la placa con un ángulo de aproximadamente 45°C durante 20–30 segundos y se observa el
arrastre de los eritrocitos, que en el caso de pocillos con inhibición completa produce una apariencia
de lágrimas translúcidas alrededor de las células. Los pocillos con inhibición parcial no producirán
arrastre en lágrima.
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b) Tipificación de aislamientos de SIV
•
Prueba de inhibición de la hemaglutinación
i)
Diluir los antígenos HA de referencia (H1, H3, etc.) a una concentración de 8 unidades HA (HAU) por
50 µl (4 HAU/ 25µl) en PBS 0,01 M, pH 7.
ii)
Estandarizar los virus desconocidos de gripe A para que contengan 8 HAU en 50 µl.
iii) Realizar una titulación (prueba HA) con todos los aislamientos desconocidos y los antígenos de
subtipo H para confirmar que están presentes las HAUs correctas. Esta titulación se realiza como se
describe en el procedimiento para HA excepto que se emplean seis pocillos en vez de once.
iv) Tratar el suero con RDE; añadir 50 µl de suero a 200 µl de RDE (enzima destructora de los receptores;
dilución 1/10 en solución salina con calcio equivalente a 100 unidades por ml). Incubar durante la
noche (12–18 horas) en un baño de agua a 37°C. Añadir 150 µl de solución de citrato sódico al 2,5% e
inactivar por calor durante 30 minutos a 56°C. Nota: se recomienda el tratamiento con RDE ya que
elimina la hemaglutinación inespecífica y favorece la identificación de aislamientos H1N2 y H3N2.
v)
Eliminar las aglutininas naturales del suero, tratando el suero diluido con 0,1 ml de eritrocitos lavados y
empaquetados por cada 1 ml de suero diluido. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente
con mezcla ocasional para mantener los eritrocitos suspendidos. Centrifugar el suero tratado a 800 g
durante 10 minutos y conservar el suero.
vi) Añadir 25 µl de antígeno estandarizado (aislamiento desconocido o control positivo de antígeno) a tres
pocillos de una placa de microtitulación con 96 pocillos de fondo en V o en U. Añadir 50 µl de PBS a
varios pocillos para servir como control de eritrocitos. Nota: se pueden utilizar 25 µl de PBS en lugar
de los 25 µl de antígeno estandarizado.
vii) Añadir 25 µl del antisuero adecuado estandarizado al primer pocillo del subtipo H evaluado. Hacer
diluciones seriadas del antisuero en volúmenes de 25 µl en los pocillos del antígeno con una pipeta de
25 µl. Repetir este procedimiento para cada subtipo H evaluado. Nota: si se utilizaron 25 µl de PBS en
lugar de los 25 µl del antígeno estandarizado en el paso vi, se añaden 25 µl del antígeno
estandarizado a cada pocillo que contenga el antisuero estandarizado.
viii) Cubrir la(s) placa(s) e incubar a temperatura ambiente durante 20–60 minutos.
ix) Añadir 50 µl de suspensión de eritrocitos al 0,5% a cada pocillo y agitar la(s) placa(s) para mezclar
bien. Mantener los eritrocitos en suspensión durante el proceso de distribución.
x)
Cubrir la(s) placa(s) con cinta aislante e incubar a temperatura ambiente hasta que se forme un botón
definido en los pocillos de control positivo (normalmente 30–60 minutos). Observar las placas después
de 20 minutos de incubación para hemaglutinación ya que algunos aislamientos pueden comenzar a
eluirse (separarse de los eritrocitos) a los 30 minutos.
xi) Leer los resultados de la prueba como se describió antes para la prueba HA. Una muestra se
considera positiva para un determinado subtipo H si se inhibe la hemaglutinación. La prueba se
considera válida si el antígeno positivo de referencia y su antígeno homólogo muestran el título HI
esperado y si la titulación de cada antígeno (desconocido y control positivo) es 8 HAUs. Si no se
presentan estas condiciones, la prueba debe repetirse.
xii) Si los eritrocitos en los pocillos de células control no sedimentan en un botón bien definido, comprobar
como posibles causas: una composición incorrecta del PBS, evaporación excesiva de las placas,
eritrocitos demasiado viejos, o concentración incorrecta de eritrocitos.
•
Prueba de inhibición de la neuraminidasa
La identificación de subtipos basada en la prueba NI supera las disponibilidades de muchos laboratorios.
Para la tipificación de los aislamientos en cuanto a N, se debe consultar a los laboratorios de referencia.
c) Prueba de inmunofluorescencia
i)
Esta técnica se puede utilizar en cortes de tejidos o en cubres/portas con monocapas celulares
infectadas. Se deben incluir controles positivos y negativos con todos los procedimientos de tinción.
ii)
Las células inoculadas se incuban lo suficiente para permitir que el 10–25% de las células se infecten
por el virus. Lavar los cubres o portas con PBS una vez, colocarlos durante 5–10 minutos en acetona
al 100% y secar al aire. La acetona debe utilizarse en una cámara aireada.
iii) Preparar cortes congelados de tejido en portas de vidrio. Fijar los portas con acetona durante 5–10
minutos y secar al aire.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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iv) Aplicar el conjugado (anticuerpo contra la gripe porcina marcado con fluoresceína) e incubar en una
cámara húmeda a 37°C durante 37 minutos.
v)
Lavar con PBS, pH 7,2, inundar durante 5–10 minutos con PBS, lavar con agua destilada y secar al
aire.
vi) Colocar los cubres sobre portas de vidrio con las células hacia abajo, con líquido de montaje. Extraer
la goma de ajuste de las cámaras de los portas y añadir líquido de montaje y después un cubre. Hacer
lo mismo para montar los cortes de tejido en portas.
vii) En una habitación oscura, observar los portas teñidos con un microscopio de luz ultravioleta. Las
células infectadas con SIV se identifican por una fluorescencia brillante verde manzana. Se
recomienda que la persona que examine las muestras tenga experiencia en la observación de
muestras marcadas con fluoresceína ya que pueden ser difíciles de interpretar.
d) Inmnuhistoquímica (19)
i)
Cortar pulmón fijado con formalina e incluido en parafina en secciones de 4 µm de grosor y colocarlas
en portas recubiertos de poli–L–lisina. Con todas las pruebas deben incluirse controles de tejido
positivo y negativo.
ii)
Calentar los portas a 60°C durante 15 minutos, eliminar la parafina, y rehidratar por inmersiones en
concentraciones decrecientes de etanol y luego en agua destilada.
iii) Tratar las muestras con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos y lavar dos veces con agua
destilada.
iv) Digerir las muestras con proteasa al 0,05% durante 2 minutos y lavar dos veces durante 2 minutos con
tampón Tris/PBS 0,1 M, pH 7,2, a temperatura ambiente.
v)
Aplicar a cada porta el anticuerpo monoclonal primario anti–SIV de ratón (dirigido contra la
nucleoproteína vírica) e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C.
Lavar los portas con tampón Tris/PBS.
vi) Aplicar el anticuerpo secundario (anticuerpo biotinilado anti–ratón de cabra) durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Lavar con tampón Tris/PBS.
vii) Aplicar el anticuerpo terciario (estreptavidina conjugada con peroxidasa) durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Lavar con tampón Tris/PBS.
viii) Añadir la solución de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Lavar dos veces con agua destilada.
ix) Teñir los portas para contraste con la hematoxilina de Gill durante 10–30 segundos, lavar con agua
durante 2 minutos, deshidratar, limpiar y añadir cubres.
x)
Los tejidos infectados con SIV se identifican por la presencia de una coloración marrón en el epitelio
bronquiolar y en los neumocitos.
e) Enzimoinmunoensayo con antígeno de captura
Se han comercializado enzimoinmunoensayos con antígeno de tipo A de captura (ELISAs) para la detección
de virus de la gripe humana. Este tipo de pruebas se han utilizado también para detectar SIV en tejido
pulmonar y en frotis nasales (10, 17). Las pruebas están generalmente disponibles en compañías del sector
de la salud humana.
f)
Reacción en cadena de la polimerasa
Se han desarrollado pruebas de reacción en cadena de la polimerasa para el diagnóstico de la gripe porcina
(6). No se dispone en la actualidad de una información amplia sobre la validación de estas pruebas.
2. Pruebas serológicas
La prueba serológica fundamental para la detección de anticuerpos frente al SIV es la prueba HI que es
específica de subtipos. Debe realizarse sobre sueros pareados recogidos con una separación de 10–21 días. Un
aumento de cuatro veces o más en el título entre la primera y la segunda muestra indica una infección reciente
por SIV. Otras pruebas serológicas que se han descrito, pero que generalmente no se utilizan, son la
neutralización vírica, la inmunodifusión en medio sólido y la inmunofluorescencia indirecta. Se ha descrito en la
literatura la tecnología ELISA para la detección de anticuerpos frente a SIV y al menos existe en el mercado un
kit comercial. La validación de las pruebas ELISA está en marcha.
1196
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•
Prueba de inhibición de la hemaglutinación
i)
Diluir los antígenos HA de referencia (H1, H3, etc.) hasta una concentración de 4–8 HAU/25 µl con
PBS 0,01 M, pH 7,2.
ii)
Prueba con H1N1: Inactivar los sueros por calor durante 30 minutos a 56°C. Diluir a 1/10 con PBS.
Añadir 0,1 ml de eritrocitos lavados y empaquetados de pollo macho a 1 ml de suero inactivado por
calor y diluido, mezclando a continuación. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos con
agitación periódica cada 10–15 minutos. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos a 4°C. Nota: como
alternativa a la inactivación por calor y el tratamiento con eritrocitos empaquetados de pollo, los sueros
se pueden tratar con RDR y con eritrocitos de pollo como se describe más adelante en el paso iii.
iii) Prueba con H1N2 y H3N2: Añadir 50 µl de suero a 200 µl de RDE (enzima destructora de los
receptores; dilución 1/10 en solución salina con calcio presentando 100 unidades por ml). Incubar
durante la noche (12–18 horas) en un baño de agua a 37°C. Añadir 150 µl de solución de citrato
sódico al 2,5% e inactivar por calor durante 30 minutos a 56°C. Combinar 200 µl de muestra tratada
con 25 µl de PBS. Añadir 50 µl de eritrocitos de pollo o pavo macho al 50% para una dilución final del
suero de 1/10. Agitar e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C.
Nota: son preferibles los eritrocitos de pollo para todos los aislamientos europeos.
iv) Depositar 50 µl de suero tratado en dos pocillos con fondo en V o en U de una placa con 96 pocillos.
Depositar 25 µl de suero tratado en dos pocillos para utilizarlos como control de suero. Los sueros
control positivos y negativos se tratan del mismo modo que los sueros desconocidos.
v)
Depositar 25 µl de PBS en los pocillos de control de suero y en todos los pocillos vacíos excepto en los
dos pocillos identificados como control de células. Añadir 50 µl de PBS a los pocillos de control de
células.
vi) Hacer diluciones seriadas dobles del suero en volúmenes de 25 µl en la placa, y después añadir 25 µl
del antígeno apropiado a todos los pocillos de la prueba excepto a los que corresponden a control de
suero y control de células.
vii) Incubar las placas cerradas a temperatura ambiente durante 30–60 minutos.
viii) Añadir 50 µl de suspensión de eritrocitos al 0,5% (de pollo para H1N1 y de pavo para H3N2) a cada
pocillo, agitar, e incubar a temperatura ambiente durante 20–30 minutos hasta que se forme un botón
definido en el fondo de los pocillos de control de células. Mantener los eritrocitos en suspensión
durante el proceso de distribución.
ix) Realizar una prueba HA utilizando los antígenos de la prueba HI antes de –y simultáneamente a– la
prueba HI, para verificar que las concentraciones de antígeno son las apropiadas.
x)
Para que la prueba sea válida no debe haber hemaglutinación en el pocillo de control de suero, ni
debe haber inhibición de la hemaglutinación con el suero negativo, además el suero positivo debe
tener su título HI anticipado y la titulación HA debe indicar 4–8 HAU por 25 µl.
b) Enzimoinmunoensayo (9)
Se ha descrito en la literatura la tecnología ELISA para detección de anticuerpos frente a SIV. Al menos una
prueba ELISA está disponible en forma de kit comercial.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas indicadas aquí y en el Capítulo I.1.7 son de tipo general y
pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
1. Control de inóculos
a) Características del inóculo
La identidad del inóculo debe estar bien documentada, incluyendo el origen y la historia de pases del
agente. Deben establecerse todas las propiedades definitorias tales como subtipos de hemaglutinina y
neuraminidasa. Para establecer los subtipos de H y de N se puede utilizar la inhibición de la
hemaglutinación y la inhibición de la neuraminidasa por antisueros específicos de subgrupo. También, se
pueden neutralizar alícuotas del virus de siembra original con antisueros específicos, como antisuero
producido contra SIV H1N1 o SIV H3N2, y después inocular en el saco alantoideo de huevos embrionados
de pollo de 10 días o en líneas celulares susceptibles, como la MDCK. El líquido alantoideo o el
sobrenadante del cultivo celular se recoge después de 72–96 horas de incubación y se prueba para
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actividad HA. La identidad se demuestra por la falta de actividad HA en el inóculo neutralizado, y la
presencia de actividad HA en el no neutralizado. Las diferencias antigénicas presentes en una cepa dada,
que la diferencie de otros miembros del subtipo y que puedan tener un impacto beneficioso en su empleo
como vacuna, deben confirmarse por secuenciación y análisis genético.
b) Método de cultivo
El inóculo de SIV se puede cultivar en huevos o en cultivo celular. La selección de un método de cultivo
depende del grado de adaptación del virus, crecimiento en el medio, velocidad de mutación, y rendimiento
vírico en el sistema específico de cultivo. Los productos de la vacuna contra el SIV deben limitarse a cinco
pases del inóculo original para evitar variación antigénica.
c) Validación del cultivo
Debe demostrarse la pureza del inóculo y de las células utilizadas para la producción de vacuna. El inóculo
original debe estar libre de agentes exógenos, bacterias o micoplasmas, usando pruebas que se sepa que
son sensibles para detectar estos organismos. La alícuota de prueba debe ser representativa de un título
adecuado para producción de vacuna, pero no tan alto como para que un suero hiperinmune sea incapaz de
neutralizar el virus del inóculo en una prueba para pureza. El virus de siembra se neutraliza con suero
monoespecífico o con anticuerpo monoclonal contra el SIV y la mezcla virus/anticuerpo se cultiva en varios
tipos de líneas celulares en monocapa. Los cultivos se subcultivan en pases cada 7 días, por lo menos
durante 14 días, cuando se prueban para agentes citopatogénicos y hemadsorbentes. Las células también
se examinan para otros virus que puedan haber infectado las células o el inóculo en pases previos. Los
contaminantes potenciales son el virus de la diarrea bovina vírica, reovirus, virus de la rabia, virus de la
enfermedad de Aujeszky (seudorabia), virus de la gastroenteritis transmisible, coronavirus respiratorio
porcino, parvovirus porcinos, adenovirus porcinos, virus de la encefalomielitis hemaglutinante, rotavirus
porcinos, circovirus porcinos, y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. Las líneas celulares
en las que se prueba el inóculo incluyen: una línea celular de riñón de mono verde africano (Vero) (para
rabia y reovirus), una línea celular porcina, una línea celular de la especie de células utilizada para propagar
el inóculo, si no es de origen porcino, y líneas celulares de cualquier otra especie por las que se haya
pasado el inóculo. Además, se recomienda una línea celular muy permisiva para el virus de la diarrea
bovina vírica, tipos 1 y 2. El virus de la diarrea bovina vírica es un contaminante potencial introducido por el
empleo del suero bovino fetal en los sistemas de cultivo celular.
Deben investigarse los factores que pueden contribuir a la inestabilidad durante la producción, como la
replicación en una línea celular no común. Si se aprueba la producción para cinco pases desde el inóculo
original, debe garantizarse la secuenciación de los genes H y N al número máximo de pases para confirmar
la estabilidad del inóculo vírico.
d) Validación como vacuna
Las vacunas candidatas deben ser puras, seguras, potentes y eficaces.
Las cepas utilizadas en la producción de vacunas deben estar relacionadas antigénicamente con las cepas
de SIV que circulan en el campo (3, 7, 18). Para la selección pueden utilizarse las pruebas de inhibición de
la hemaglutinación y de neutralización que demuestren reacción cruzada entre antisueros de animales
vacunados con la cepa vacunal candidata y aislamientos actuales de campo. Un estudio de
vacunación/desafío en el cerdo, utilizando cepas de desafío homólogas y heterólogas, indicará el grado de
protección aportado por la vacuna. Los cerdos utilizados en estos estudios deben estar libres de anticuerpos
contra el SIV. Los estudios sobre vacunación/desafío deben realizarse con virus producido según el método
previsto de fabricación, al máximo número de pases del virus permitido, y con cerdos de la edad mínima
recomendada en la etiqueta de la vacuna. Inicialmente, los lotes se componen de varias cantidades de
antígenos. El lote problema que contenga la menor cantidad de antígeno que confiera protección es el
estándar frente al que se miden los lotes de la futura producción. El mejor criterio para ensayos de
evaluaciones de grupos de tratamiento es una notable reducción de virus (títulos y duración de la excreción)
en el tracto respiratorio de cerdos vacunados. También son criterios las diferencias en la observación clínica
de lesiones pulmonares. Si se emplean métodos in vivo o in vitro para determinar la potencia de cada lote
de producción de vacuna, los ensayos deben hacerse en paralelo con estudios del antígeno mínimo para
establecer criterios de puesta de la vacuna en el mercado. En algunos países se dispone de vacunas
combinadas que contienen más de una cepa de SIV. La eficacia de los diferentes componentes de estas
vacunas debe establecerse independientemente y en combinación, en caso de que exista interferencia
entre los distintos antígenos.
2. Método de producción
Una vez que la vacuna se muestra eficaz, y que las condiciones de fabricación propuestas resultan aceptables a
las autoridades competentes, se puede obtener la aprobación para la producción de la vacuna. En general, los
sistemas de monocapa o de suspensión celular a gran escala operan bajo estrictas condiciones asépticas
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controladas por temperatura y con métodos definidos de producción que aseguran una repetición de lote a lote.
Cuando el virus alcanza su título máximo, determinado por HA, ECP, inmunofluorescencia u otra técnica
aprobada, el virus se clarifica, se filtra y se inactiva. Se han utilizado con éxito varios agentes inactivantes, como
formalina y etilenimina binaria. Debe realizarse un estudio de la cinética de inactivación con el agente inactivador
aprobado, en un lote de virus con un título mayor que el título máximo de producción y crecido en las condiciones
del método de producción aprobado. Este estudio debe demostrar que el método de inactivación es adecuado y
asegura la inactivación completa del virus. Las muestras tomadas a intervalos durante la inactivación, cuando se
inoculan en una línea celular susceptible o en el saco alantoideo de huevos embrionados, deben indicar una
pérdida lineal y completa del título al final del proceso de inactivación. Esto supone menos de una partícula
infecciosa por cada 10
4
litros de líquidos después de la inactivación. Generalmente se añade un adyuvante para
aumentar la respuesta inmune. A menudo, el adyuvante es un aceite mineral, aunque otros adyuvantes pueden
ser igualmente eficaces.
3. Control del proceso
Los cultivos celulares deben comprobarse macroscópicamente para descartar anormalidades o signos de
contaminación y se deben desechar si no resultan satisfactorios. Un lote está listo para la recogida cuando el
ECP vírico alcanza el 80–100%. La concentración de virus se puede determinar utilizando la masa de antígeno o
ensayos de infectividad.
4. Control de lotes
a) Esterilidad
Durante la producción se deben realizar pruebas para contaminación por bacterias, micoplasmas y hongos,
tanto en los lotes de recogida de vacunas inactivadas como en los de vivas, y se deben confirmar en el
producto final (ver Capítulo I.1.5.).
b) Inocuidad
Para evaluar la inocuidad de un producto inactivado se pueden emplear ratones o cobayas. En un modelo,
se inoculan ocho ratones intraperitonealmente o subcutáneamente con 0,5 ml y se observan durante 7 días.
La prueba de inocuidad en ratón puede no ser aplicable cuando se usan ciertos adyuvantes, especialmente
productos derivados de saponina. En otro modelo, dos cobayas se inyectan con una dosis de 2 ml cada uno
intramuscularmente o subcutáneamente y se observan durante 7 días. La aparición de síntomas clínicos
adversos o de mortalidad atribuibles a la vacuna indican que el lote no es aceptable para uso. La
inactivación completa del virus en un producto inactivado puede determinarse por múltiples pases de los
líquidos producidos, después de la inactivación y antes de la adición de adyuvante, en cultivos celulares o
en huevos, seguidos de pruebas HA para detectar la presencia de virus.
El producto final puede examinarse en el animal hospedador utilizando dos animales de la edad mínima
para la que se recomendada su empleo, de acuerdo con las instrucciones dadas en el prospecto del
producto; los animales se observan durante 21 días. También se recomiendan estudios de inocuidad en el
campo sobre animales vacunados, en un mínimo de tres áreas geográficas distintas y al menos con
300 animales por área. Si la vacuna se utiliza en cerdos destinados al mercado para consumo humano,
debe establecerse un tiempo de aislamiento en consonancia con el adyuvante empleado (generalmente
21 días) por medio de examen histopatológico enviado a las autoridades competentes en seguridad
alimentaria.
c) Potencia
Para establecer que durante la producción se alcanzan los títulos mínimos, se mide el contenido antigénico.
Generalmente, el contenido antigénico se mide antes de la inactivación y previamente a cualquier proceso
posterior. Entre las pruebas que pueden utilizarse para determinar el contenido antigénico en el producto
final están ELISA para potencia relativa, HA y HI. Es necesario confirmar la sensibilidad, especificidad,
reproducibilidad y severidad de tales pruebas.
d) Duración de la inmunidad
Antes de que se apruebe un producto, debe determinarse la duración de la inmunidad y la frecuencia de
vacunación recomendada. En principio, esta información se adquiere directamente de estudios de
vacunación y desafío utilizando el animal hospedador. El período de protección demostrada, medido por la
capacidad de los animales vacunados para resistir inoculaciones de desafío en una prueba validada, se
puede especificar en las indicaciones del prospecto de la vacuna comercial. Una vez que se ha identificado
una prueba de potencia adecuada, si la deriva antigénica requiriera reemplazar las cepas de la vacuna, se
pueden examinar cepas del mismo subtipo en el animal hospedador o en un modelo apropiado de animal de
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laboratorio. Sin embargo, las cepas circulantes pueden mostrar diferencias antigénicas notables con la cepa
vacunal, pero la cepa vacunal puede suministrar aún protección. También, puede que la vacuna no proteja
contra una nueva cepa que parece antigénicamente similar a la de la vacuna. En consecuencia, parece que
la eficacia de las cepas vacunales siempre tiene que ser evaluada en el cerdo.
e) Estabilidad
Las vacunas deben guardarse a 4°C + 2°C con una exposición mínima a la luz. La caducidad debe
determinarse utilizando, a lo largo del período de validez propuesto, la prueba aprobada de potencia
Conservantes
El conservante más común es el timerosal a una concentración que no supere el 0,01% (1/10.000). La
adición de timerosal o de otros compuestos mercuriales debe evitarse en lo posible. Además, en el producto
final pueden estar presentes antibióticos residuales del medio de cultivo celular en cantidades restringidas.
Por ejemplo, la gentamicina residual no debe exceder de 30 mcg por ml de vacuna.
g) Precauciones
Las vacunas inactivadas contra el SIV no presentan un peligro especial para el usuario, aunque la
inoculación accidental puede originar una reacción adversa debido al adyuvante y a componentes
secundarios de la vacuna. En general, con vacunas inactivadas contra el SIV pueden vacunarse con
seguridad los cerdos sanos destetados y las cerdas grávidas en cualquier fase de gestación.
5. Pruebas sobre el producto final
a) Inocuidad
Las muestras de los recipientes finales con el producto completo de las vacunas inactivadas deben
probarse en ratones jóvenes como se describe en la Sección C.4.b.
b) Potencia
Para evaluar los nuevos lotes que se comercializan, debe utilizarse la prueba de potencia que se establece
al estudiar la protección con el mínimo de antígeno. Se necesita que la prueba sea específica y
reproducible. Debe detectar con fiabilidad las vacunas que no son suficientemente potentes. Si se utiliza
serología de animales de laboratorio en vez de serología del cerdo, debe demostrarse primero que la
vacunación de los animales de laboratorio induce una respuesta específica, sensible y dependiente de la
dosis según se mide en la prueba de potencia, y que se correlaciona con la protección en el cerdo (Sección
C.1.d.).
REFERENCIAS
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Además, científicos canadienses dijeron haber completado por primera vez la decodificación de la secuencia genética del virus H1N1, la designación oficial de la OMS de la gripe porcina, lo cual podría ayudar a desarrollar una vacuna y que prueba que los virus aparecidos en México y Canadá son similares.
"Ya hemos iniciado el proceso de desarrollo de la vacuna", dijo Anthony Fauci, director del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIH).
Por su parte, funcionarios de salud estadounidenses aseguraron que su país trabaja rápido para desarrollar una vacuna, pero advirtieron que todavía hay mucho que no saben sobre el virus H1N1.
La OMS elevó el nivel de alerta. En Colombia se estudian 59 casos sospechosos. Al borde de una pandemia inminente se encuentra el mundo, debido a los casos reportados de influenza porcina en varios países. Así lo anunció ayer la Organización Mundial de la Salud, OMS, al elevar el nivel de alerta por esta gripe a una fase 5, una menos que el máximo. La decisión fue tomada por la directora general de la OMS, Margaret Chan, después de comprobar casos humanos de gripe porcina en México, Estados Unidos, Canadá, Gran Bretaña, Israel, Nueva Zelanda y España. “Toda la humanidad está bajo la amenaza de una pandemia”, dijo Chan, quien hizo un llamado a gobiernos, industrias farmacéuticas y a la comunidad de negocios para que unan sus esfuerzos y recursos y puedan afrontar esta crisis. Según el manual de fases de alerta de la OMS, el grado 5 se declara cuando existe transmisión del virus de persona a persona en al menos dos países. Con la activación de la fase 5, los países afectados deben adoptar una serie de recomendaciones, aunque serán libres de aplicarlas a su manera. Estos planes incluyen la preparación de vacunas. Varios laboratorios como el suizo Novartis o el francés Sanofi Pasteur indicaron haber sido contactados por la OMS. Pero, según una alta responsable sanitaria estadounidense, no se dispondrá de vacunas antes de septiembre. Mientras tanto, la OMS recomendó los antivíricos Tamiflu, del suizo Roche, y el Relenza, del británico GlaxoSmithKline. Entre tanto, ayer en Estados Unidos se reportó la muerte de un bebé de 23 meses, que se convierte en la primera víctima de gripe porcina en este país. Este fallecimiento se suma a las 159 muertes registradas en México, de las cuales 7 fueron confirmadas. Lo que indica que hasta el momento el virus ha causado ocho muertes en el mundo. En España, el Ministerio de Sanidad y Política Social elevó a diez el número de personas infectadas por el virus de la influenza porcina y en Canadá también se reportaron otros seis posibles infectados. Aumentan casos en Colombia A 59 aumentó el número de casos sospechosos de este virus en Colombia, según lo anunció ayer el Gobierno Nacional. Aunque el martes sólo se reportaron 42 personas que permanecían bajo observación médica por presentar síntomas compatibles con los que provoca el virus de la gripe porcina, ayer el ministro de la Protección Social, Diego Palacio, reveló que ya hay otros diez casos sospechosos. Al tiempo que el número de pacientes de alto riesgo pasó de cuatro a diez. “Estos casos corresponden a personas que tienen una infección respiratoria aguda o alta, acompañada de fiebre de más de 38 grados. Y que, además, reportan antecedentes de haber viajado a México en los últimos días. Los sospechosos de alto riesgo fueron detectados en Bogotá, el Caribe y Antioquia”, indicó. Palacio también anunció que el Gobierno importó otras 200.000 dosis de antivirales, que, junto con las otras que se tenían dispuestas inicialmente, suman 426.000 para atender a la población que resulte contagiada. Por otro lado, ayer en Cali se reportaron otros seis casos sospechosos, aunque también fueron descartados seis de los siete que se tenían el martes. “Esto quiere decir que actualmente sólo tenemos bajo observación a siete personas, que se les aplicó la prueba del hisopado orofaringeo. Esperamos que los resultados, que fueron enviados al Centro de Enfermedades Contagiosas en Atlanta, estén listos en cinco o seis días”, declaró Alejandro Varela, secretario de Salud de Cali. Recomendaciones Si tiene síntomas de gripa, quédese en su casa, aislado del resto de la familia y use tapabocas todo el tiempo. Frecuente lavado de manos con jabón. Seleccionar un plato y unos cubiertos particulares para la persona infectada. Mantener con las ventanas abiertas la habitación donde esté el paciente. Si presenta fiebre de más de 38°, notifique al médico o vaya a un centro de salud. No hay posibilidad de que el virus se contagie por consumo de carne porcina.
En Palmira, Cartago y Tuluá se estudian tres casos. Para reportar otros posibles infectados, llamar al tel. 620 6820.
Crisis. Prácticamente desierto se encontraba ayer el aeropuerto Benito Juárez de México D.F., tras el anuncio de que posiblemente la Unión Europea suspenda los vuelos.
articulo tomado delAfp / El País
a.
CH3-CH2-CH=CH2+H2
b.
CH3-CH2-CH=CH-CH2- CH3
c. . CH3-CH2-CH=CH2 +Br2
d. CH3-CH2-CH=CH2+ HBr
o
10. Uno de los siguientes compuestos es un
aromatico
A.
B.
C.
a. Cl
b.Cl -Cl
c.
Cl –Cl
d
CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH3
+H2 CH3-CH2-CH2------CH2-CH2-CH3
